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流行性脑脊髓膜炎球菌及抗体的实验室检测

时间:2010-07-08

一、脑膜炎球菌的实验室诊断

1脑膜炎球菌感染的检测

1.1 细菌学检测:临床最常用的方法是取标本如淤点淤斑、咽拭子及脑脊液(CSF)做细菌培养,获得阳性结果可以确诊。方法是,取标本先接种至血清肉汤培养基增菌后,再在巧克力琼脂平板上划线分离。平板置5%CO2环境中孵育,挑取可疑菌落涂片染色检查,并做生化反应和玻片凝集试验进行鉴定。此法需时较长,灵敏度也低。约1/3未经抗菌药物治疗的流脑患者血培养为阳性。也可取上述标本直接做涂片找革兰阴性双球菌,但这种较快速的方法仅为形态学检查的结果,因有主观误差仅供诊断参考。因脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感,故标本采集后注意保暖保湿并立即送检。接种的培养基宜预温,以免细菌死亡,影响检出率,最好是床边接种。

1.2 基因诊断:主要是用聚合酶链反应(PCR)将相应细菌基因片段扩增。标本可用CSF、血清或全血,当细菌培养阴性,而凝集实验又常常敏感性和特异性较低,故可采取基因扩增的方法,它具有快速、灵敏、特异性较强、标本用量少的特点[34],目前较为受关注,我国很多医疗科研机构也开展此方法。但此方法存在假阳性率较高的问题,有报道联合应用Southern blots或PCR-ELISA可提高灵敏度、特异性。目前已研究出并应用于PCR的基因有:编码荚膜转运蛋白的ctrA基因, B、C、Y、W135群共有基因siaD,编码外膜蛋白的porA、porB基因, IS1106插入序列。

1.3 免疫学检测:利用抗原抗体反应原理检测脑膜炎球菌的荚膜多糖抗原或抗体,较以上方法更为敏感。据报道被选用的实验方法主要有:①对流免疫电泳:可检测患者血、皮肤淤点及淤斑,约0.5~1小时出结果。此法较常规培养法敏感,特异性也高,且对已经抗生素治疗的患者也可用此法来协助诊断。②乳胶凝集试验:检测患者脑脊液中的抗原,阳性率亦为60%。③血凝抑制法:可测定抗原及作分群鉴定。④反向血凝法:测定患者血或脑脊液中的抗原,简便快速。⑤炭凝法:阳性率可达80%。⑥葡萄球菌A蛋白协同凝集法:先用脑膜炎奈瑟菌IgG抗体标记Cowan Ⅰ葡糖球菌,然后加入待测标本(血清或脑脊液),若标本中含有相应可溶性抗原,则可见葡萄球菌聚集在一起的凝集现象。此方法可检测死菌、活菌的抗原,15分钟可获结果,阳性率较高,试剂较稳定,至少可维持8个月[46]。⑦放射免疫法:灵敏度高,但存在同位素污染的缺点。⑧免疫荧光法:用异硫氰荧光素标记脑膜炎球菌抗体以检测其抗原。⑨酶联免疫吸附法:更为简便、快速、特异性较强。

其他方法:也有报道用鲎试验、重氮胶乳凝集试验、C-反应性蛋白等方法对流行性脑脊髓膜炎进行辅助诊断。

二、抗体水平测定

国内外应用各种方法测定血清中的免疫球蛋白、特异抗体,免疫水平测定对于临床检验、疫苗接种后抗体阳转情况分析、人群抗体水平的流行病学调查都有重要意义。目前主要应用的手段有以下介绍的几种。

1、间接血凝:用特异性多糖致敏红细胞后做间接血凝试验,可测定血清中的多糖中和抗体。将新鲜红细胞用戊二醛固定,加保护剂冻干,可保存2年。该方法属半定量测定,测定结果的重复性较差,抗体水平测定可相差2~4倍,不同批次的试剂差别较大,目前已基本被淘汰。

2、乳胶凝集:是应用较广泛的快速诊断方法。试剂的效期为12个月,可用于定性实验,不能对抗体的含量进行精确测定,属半定量检测,目前只有英国一家公司提供该种试剂。

3、血清杀菌力试验(SBA):自从二十世纪初就掌握了抗体和补体对流脑疾病的保护性,SBA很早就被证实与流脑疾病的免疫力高度相关。将待测血清进行热灭活内源性补体,将不同稀释度的抗血清加补体与相应的活菌液在37℃作用30~60分钟,之后将此混合物接种于平板或微孔无菌塑料板内,在CO2环境中培养,计算活菌数目,如活菌比加入时少50%-90%以上,说明有杀菌力。国内多用简化的TTC显色法,结果较敏感、简化,目前在国内外对血清抗体水平的调查时基本沿用这种方法。

1976年,WHO生物标准专家委员会提出用SBA作为流脑多糖疫苗的血清学试验的评估,以90%以上免疫后成年人SBA血清滴度4倍或4倍以上增长用于评估疫苗效力,支持疫苗认证。很久以来,虽然很多研究者和试验室都在应用SBA,但这些方法至今没有得到统一,随着新疫苗的不断开发和应用,一个标准的统一方法的建立很有必要。不同试验室应在参比试验室的统一下使用相同的试剂、菌株和试验程序,若以非标准的SBA用于新疫苗功能性抗体的检测,所得结果可能会偏高或偏低,从而不能准确评价疫苗的效力而延误其研究及认证。

血清杀菌力试验在应用时较费时费力,试验人员的主观对结果的判断影响较大。很多客观实验情况也可影响抗体的杀菌活性,如试验过程中就有诸多影响因素:菌株的选择、培养条件的掌握(如固体或液体培养基)、克隆形成单位的应用数量、补体的来源等等,这些条件目前尚无国际统一标准,大大影响了SBA的应用。尤其目前对补体的来源争议较大,理想的补体来源应是未经治疗的丙种球蛋白缺乏症但补体功能正常的患者血清,这种血清中的外源抗体的影响可降至最低。但由于丙种球蛋白治疗的广泛应用,这种血清的来源数量很少。上世纪60年代曾有过用健康人为补体源进行血清杀菌活性与脑膜炎球菌疾病保护性之间关系的研究。Zollinger和Mandrell首先报道对B群脑膜炎球菌用异源补体可引致偏高的血清抗体杀菌滴度。最近研究这种情况对于A、C群脑膜炎球菌都有发生。英国在检测A/C脑膜炎球菌结合疫苗使用3针后杀菌抗体滴度时,发现使用兔源补体比人源补体高了8个几何平均滴度。也有研究者发现,对成人首次免疫接种A/C结合疫苗,4年后接种单纯多糖疫苗,对A血清群几何平均滴度而言,用兔源补体的结果近70倍高于人源补体。尽管血清杀菌试验为临床评估保护性提供了一个很好的免疫学方法,但结果会受试验原理的影响,特别是人和兔源补体的选择。因为理想的人源补体在实际中很难获得,除B群用人源补体外,WHO推荐A、C群用幼兔补体测定血清杀菌抗体效价。

SBA试验是经典的用于脑膜炎球菌抗体水平测定的方法,结果可反应人体对脑膜炎球菌的抵抗力,是脑膜炎球菌抗体测定的金标准。但其致命的缺陷是该方法在不同的实验室间测定时,结果差别较大,抗体效价可有几十倍的差别,即便是不同的实验室均采用统一的操作方法,抗体效价的差别仍有2~8倍的差别。该方法测定的结果在不同的实验室之间无可比性,若用于不同地区人群免疫水平比较,最好在同一个实验室内完成。在同一个实验室内测定时,血清抗体效价可有2~4倍的差别。该实验的主要影响因素是所采用的新鲜幼兔补体的质量、所加入的活菌的数量及菌株的来源、反应时间、以及人为因素对判定结果客观的影响。SBA不适用于大面积或大样本量人群抗体免疫水平的测定。

4. 酶联免疫吸附试验(ELISA):用酶标记抗原或抗体,以测定相应的同种抗体或抗原,应用此法可分别测定IgG和IgM抗体。目前的候选包被抗原主要有以下几种,现分别介绍如下:

1)细菌抗原:一般用热灭活脑膜炎球菌法进行抗原准备。虽可测出抗脑膜炎球菌多种抗原的抗体,但由于非致病性共生奈瑟氏菌和一些大肠杆菌与脑膜炎球菌之间有共同抗原成分,彼此可以产生交叉反应。此外,脑膜炎球菌的外膜蛋白及脂寡糖在不同血清群之间也可产生交叉反应,故用全菌体进行包被,虽然可较全面测出抗体,但其群的特异性较差,不能用于血清抗体水平的评价。

2)纯荚膜多糖(Capsular Polysaccharides CPSs)抗原:荚膜多糖的提取技术已非常成熟,以不同群别荚膜多糖包被,可以对抗体进行分群检测是其一大优点,但因常用的聚苯乙烯板对单纯的荚膜多糖的吸附力较弱,同时荚膜多糖本身容易降解或发生断列,使其稳定性差而不能成为商品化的诊断试剂盒。该种试剂效期极短,只能用于实验室内部临时包被抗原,当天或次日内使用,孔间差别亦较大。

3)荚膜多糖、甲基化人白蛋白混合包被抗原:该方法为1992年美国CDC开发的方法。1996年WHO在日内瓦召开关于评估A、C群流脑疫苗的血清学试验室标准时推荐使用的一种标准ELISA方法,即将甲基化的卵清蛋白(mHSA)与荚膜多糖混合进行包被,该种包被方法可在短时间内有效的减轻荚膜多糖的降解,稳定性优于单纯的荚膜多糖包被,有效期(货架寿命)为14天。在14天的有效期之内,可用于抗体含量的定量测定。

4)荚膜多糖-蛋白结合物包被抗原:将多糖与无关蛋白通过化学反应共价连接为偶联物。试剂具有良好的重复性。试剂盒有效期为12个月。属近5年内新开发的检测试剂,也是目前最理想的脑膜炎抗体ELISA检测试剂。12个月内检测结果显示A值及P/N值基本无改变,弱阳性样品仍可被检出,灵敏度无变化,说明聚苯乙烯板对结合在蛋白上的多糖吸附牢固而持久,试剂具有优良的稳定性。该试剂盒孔间误差小于3%,可用于多糖抗体含量的定量测定。检测NIBSC 99/706 脑膜炎球菌多糖抗体标准血清,在给定的范围内,相关系数r可达到0.980~0.999,可以很好的用于人群保护性抗体水平的测定(大于或等于2mg/ml抗体,可有效的抵御同群脑膜炎球菌的感染),实验的重复性好,测定的变异系数小于10%。缺点是制造成本较高,目前只有美国、德国及我国北京绿竹生物技术有限责任公司开发出了此种高稳定性的多糖抗体定量检测试剂。该种试剂与SBA的相关性优于20世纪90年代WHO推荐的标准ELISA方法。它相对于SBA的灵敏度(真阳性率)为96.91%,特异度(真阴性率)90.00%(SBA因灵敏度低,存在一定程度的假阴性),经χ2检验,两种检验方法无显著差异。通过对不同地区、不同免疫水平的912份儿童血清样品进行检测,结果显示该种ELISA试剂可准确检测出血清效价从1/25到1/25600范围内的抗体(检测下限5ng/ml)。

目前,流脑流行菌群在逐渐的变化,新的结合疫苗亦在不断研究和上市,对人群免疫水平及新疫苗评价工作尤显重要,若能将与SBA相关性较高的ELISA方法用于人群脑膜炎球菌抗体的定量检测和评价,将费时费力、易变性大的杀菌力试验取代,无疑会将评估工作的效率和精确性大大提高。目前基层单位酶标仪普及,ELISA检测试剂易于进行大规模生产,可对大面积人群免疫状况进行评测、流行病学调查,质量稳定,试验流程固定,操作误差小,适用于进行大面积人群血清检测和流行病学调查。

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