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免疫学检测常用标记技术

时间:2010-07-15

一、免疫荧光技术(immunofluorescence,IF)

基本原理:以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂,用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。免疫荧光技术分为两大类:一类是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原(或抗体)进行鉴定和定位检测,可在荧光显微镜下直接观察实验结果,或是应用流式细胞术进行自动分析检测;另一类方法是用于体液标本中抗原或抗体的测定,称为荧光免疫测定。

(一)免疫荧光显微技术

1. 直接免疫荧光法应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。

2. 间接免疫荧光法应用特异性抗体(或待测抗体)为第一抗体,以荧光素标记的抗球蛋白抗体(标记的抗抗体)为第二抗体,可检测抗原或抗体。

3. 补体结合免疫荧光法此法是在间接法的第一步抗原-抗体反应时加入补体,使之与抗原-抗体复合物结合;再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。

此外,还可应用双标记法。此法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体,进行同一标本的荧光染色,若有相应的两种抗原存在,可同时见到两种(橙红、黄绿)荧光。

(二)流式细胞术(flow cytometry . FCM)

FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪,对单个细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测,并可将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析,故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。

(三)荧光免疫测定(fluoroimmunoassay . FIA)

1. 荧光偏振免疫测定(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)该法主要用于小分子物质(特别是药物浓度)的测定,其原理是:荧光物质经偏振光蓝光照射而跃入激发态,在恢复至基态后可释放出光子,经偏振仪形成偏振光,进行免疫测定时,采用均相竞争结合法,偏振光的强度与样品中待测物质的浓度成反比。

2. 时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoroimmunoassay,TR-FIA)原理:应用具有较长荧光寿命的镧系稀土元素标记抗原或抗体,并利用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间,有效地消除非特异性本底荧光的干扰,所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光,从而最大限度地提高测定方法的灵敏度和特异性。

3.酶联荧光免疫测定(enzyme linked fluoroinmunoassay,ELFIA)原理:应用具有潜在荧光的物质作为酶的底物,经过酶解反应产生高强度荧光,可用荧光测量仪进行定量测定

二、放射免疫测定

放射免疫测定(radioimmunoassay,RIA)是以放射性核素作为示踪剂的标记免疫测定方法,它将核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合。

(一)放射免疫测定(RIA)

以放射性核素标记的抗原(Ag*)和检品中待测的未标记抗原(Ag)抗原与固定量的特异性抗体竞争结合,或进行竞争性抑制反应。当Ag*和Ab的量固定时,二者结合形成Ag*-Ab复合物受Ag含量的制约。若反应系统中Ag含量高,因其对Ab的竞争结合能力强,Ag-Ab复合物的生成量就增加,Ag*-Ab复合物即相对减少。因此,Ag*-Ab复合物的形成量与Ag含量之间呈一定的负相关函数关系。

(二)免疫放射测定

免疫放射测定(immunoradiometric assay,IRMA)是将待测抗原与过量的标记抗体直接反应,然后加入固相的抗原免疫吸附剂与游离的标记抗体结合。经过离心去除沉淀物,测定上清液的放射性强度,从而推算出检品中待测抗原的含量。反应原理见图21-6。

三、免疫酶标技术( enzyme immunoassay, EIA)

基本原理:以酶标记抗体(或抗原)用于免疫学检测,通过相应底物被酶解后的显色反应,对细胞和组织标本中的抗原-抗体复合物进行定位,定性分析和鉴定,亦可根据酶催化底物显色的深浅程度,定量测定体液标本中待测抗原或抗体的含量。

(一)酶免疫组织化学技术(enzyme immunohistochemistry, EIH)

基本原理:与荧光抗体技术相似,但通过底物被酶解显色来示踪抗原-抗体结合物的存在部位。酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察,并能长期保存。此外,作为辣根过氧化物酶底物的二氨基联苯胺(DAB)的分解产物适于电镜观察。

1、ABC法  此法是将亲和素(A)与生物素(B)标记的过氧化物酶结合,形成可溶性的亲和素-生物素化过氧化物酶复合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)。当其与生物素标记的抗体(直接法)或抗抗体(间接法)作用时,ABC中亲和素尚未饱和的位点可与抗体分子上标记的生物素结合,从而形成一个多级放大体系,有效提高酶反应的敏感性。

2、PAP法和APAAP法  过氧化物酶-抗过氧化物酶法(PAP)和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法(APAAP)的原理是:应用抗酶抗体与酶结合,形成可溶性的、稳定的酶-抗酶抗体复合物。此法的优点是:未经化学交联反应,故避免了抗体和酶活性降低,并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。

(二)酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)

1.非均相酶免疫测定(heterogeneous enzyme immunoassay)根据是否使用固相支持物作为吸附抗体(或抗原)的载体,可分为固相EIA的液相EIA两类方法。其中常用的固相EIA法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),此法以聚苯乙烯制品或NC膜等作为固相载体,分为以下三种基本方法。

(1)间接法:此法是测定抗体的常用方法。

(2)双抗体夹心法:此法是检测大分子抗原的常用方法。
双抗体亦用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体,分别作为固相抗体和酶标抗体。测定时只需将加入待检标本和酶标抗体合并为一步。

(3)竞争结合法:此法可用于测定抗原,亦可用于测定抗体。以检测抗原为例,待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,结果结合于固相的酶标抗原量与样品中待测抗原的含量成反比

2.均相酶免疫测定(homogeneous enzyme immunoassay,HEI)HEI法的特点是只需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合,待抗原-抗体反应完成即可直接测定结果,整个检测过程都在均匀的液相中进行。本节仅以酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)为例简介。EMIT的原理为:酶与半抗原结合成酶标半抗原,继而与抗体结合;标记酶由于与抗体接触产生空间位阻,其活性被抑制;同时加入检品时,其中的待测半抗原和酶标半抗原竞争与抗体结合,使游离的标记物增多,酶的活性得以发挥,催化底物显色较深。酶活性的增强与检品中待测半抗原的量呈负相关。

四、发光免疫技术

发光免疫测定(luminescence immunoassay,LIA)是将发光系统与免疫反应相结合,用于检测抗原或抗体。化学发光技术亦可用于吞噬细胞功能的测定。

1.化学发光免疫测定(chemiluminescence immunoassay,CLIA)CLIA是以化学发光剂(如鲁米诺,吖啶酯等)标记抗体或抗原,免疫反应完成后,直接引发化学发光反应进行检测。

2.生物发光免疫测定(bioluminescence immunoassay,BLIA)BLIA是利用生物发光物质(如萤火虫荧光素)或参与生物发光反应的辅助因子(ATP、NAD等)标记抗原或抗体。免疫反应完成后,利用生物发光反应进行检测。

3.化学发光酶免疫测定(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)CLEIA的抗原-抗体反应步骤与酶免疫测定相同,仅酶促反应所用的底物为发光剂,通过化学发光反应进行检测。

还有电化学发光免疫测定(electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA),该法实实际上是在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。

五、免疫金标记技术

免疫金标记技术(immunogold labelling technique)是以胶体金作为示踪标志物,应用于抗原-抗体反应。胶体金由于具有高电子密度,最初主要用于免疫电镜技术,以后其应用范围逐步扩展,例如:在免疫组织和细胞化学方面,胶体金标记的抗体可直接用于检测细胞表面和组织切片中的抗原或受体,并可在普通光学显微镜下观察,称为免疫金染色法(immunogold staining,IGS);在IGS的基础上,发展为用银离子增强免疫金标记技术的敏感性,称为免疫金银染色法(immunogold silver staining,IGSS);在固相免疫测定中,常用的方法有斑点免疫金银染色法(dot IGS/IGSS)、斑点免疫金渗滤试验(dot immunogold filtration,DIGFA)和斑点免疫渗滤试验(dot immunochromatographic assay,DICA)等,其共同特点是用NC膜或微孔滤膜为载体吸附抗原,用胶体金标记抗体代替酶标抗体;在流式细胞术中,胶体金可作为流式细胞术多参数细胞分析和分选的有效标记物。

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