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免疫学检测

摘自龚非力主编《医学免疫学》第3版第21章          时间:2010-07-16

免疫检测技术可分为3个水平:①细胞水平检测,用根据各业免疫细胞膜表面所表达的独特标志及其特殊功能,在体内外检测细胞有其亚群数量和功能;②分子水平检测,是测定各类免疫球蛋白、补体、细胞因子及其受体、黏附分子表达水平和生物学活性;③基因水平检测,即测定免疫应答相关基因表达与调控、免疫分子遗传多态性及基因型别分析。

一、免疫细胞的检测

研究免疫细胞在免疫应答中的作用与相互关系,借以了解机体的免疫状态,并用于疾病诊断、疗效观察及预后判断。

(一)淋巴细胞及其亚群检测

不同类别淋巴细胞表面携带特定表面标志,借此可对不同细胞群及其亚群进行鉴定和计数。

1.T细胞检测

►间接免疫荧光法

►免疫组织化学法

►葡萄球菌花环法

►微量细胞毒试验

2.B细胞检测

►膜表面免疫球蛋白检测

►间接免疫荧光法

B细胞亚群检测

(二)免疫细胞功能测定

1.吞噬细胞功能测定

 ● 中性粒细胞趋化功能测定

  滤膜渗透法(Boyden小宝法

  琼脂糖平板法

 ● 中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定

  显微镜检法

  硝基蓝四氮唑还原试验

  化学发光测定法

 ● 巨噬细胞吞噬功能测定

 ● 巨噬细胞胞毒作用测定

2.T细胞功能测定

(1)T细胞增殖(转化)试验:T细胞在体外受抗原或丝裂原刺激后,细胞代谢和形态发生变化,主要表现为胞内蛋白质和核酸合成增加,发生增殖反应并转变为淋巴母细胞。

►形态学观察

►放射性核素(3H-TdR、125I-UdR)渗入法

►细胞能量代谢(MTT比色法)

►检测抗TCR V等位基因片段产物

(2)T细胞介导的细胞毒试验

(3)T细胞分泌功能测定

(4)T细胞功能体内检测法

►接触性超敏反应

►移植物抗宿主反应(GVHR)

►细胞能量代谢(MTT比色法)

►迟发性超敏反应(DTH)

(5)抗原特异性T细胞检测

(6)T细胞克隆技术

3.B细胞功能测定

(1)B细胞增殖试验

(2)溶血空斑形成试验

(3)定量溶血分光光度测定法

(4)反相溶血空斑试验

(5)酶联免疫斑点法

4.NK细胞活性测定

(1)形态学检查法

(2)放射性核素(51Cr、125I-UdR)释放法

(3)酶释放法

(4)化学发光法

(5)流式细胞术

二、免疫分子的检测

(一)免疫球蛋白测定

测定方法分为两类:①在体外用已知抗原检测相对应抗体;②应用多克隆或单克隆抗体,对各类Ig进行类别鉴定与定量测定。

检测IgG、IgA、IgM含量常用单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法及免疫比浊法。目前使用免疫化学自动分析仪,可同时测定血清中多种Ig、补体成分及其他血浆蛋白含量。血清中IgE、IgD含量很低,须用放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)等灵敏度较高的方法测定。

(二)补体测定

1.血清总补体活性测定

2.血清补体旁路途径活性测定

3.补体各种成分测定

补体系统包括30余种组分,通常仅检测C1q、C3、C4、B因子和C11NH。

►免疫溶血法:SRBC与相应抗体结合可激活补体经典途径,导致红细胞溶解;抗体致敏的SRBC与某一补体成分缺乏的血清作用后,不发生溶血;加入待检血清标本补偿原来缺乏的补体成分,即发生溶血。此法可诊断补体特定成分(C4、C2及B因子)缺乏,或诊断补体含量正常但溶血活性不足等先天性缺陷。

►免疫化学法:应用特异性抗体定量检测相应补体成分及其裂解产物,常用方法有单向免疫扩散法、火箭免疫电泳法、免疫比浊法、ELISA及RIA等。

4.补体裂解产物的测定

5.补体受体测定

常用检测方法:

►EAC花环试验

►FBC(荧光素标记细菌-补体)花环试验

►酵母多糖-补体花环试验

►补体单一成分或其裂解产物(C3b、C3d、C5a等用酶或荧光素标记后直接(或间接)用于检测细胞表面相应的补体受体(CR)

►可用酶、荧光素、胶体金标记抗CR抗体,直接检查细胞膜表面CR

(三)细胞因子及其受体检测

细胞因子检测包括生物学活性、免疫学及分子生物学方法。

1 . 生物学检测法

根据细胞因子特定的生物学活性采用相应指示系统,通过与标准品对比,判断样品中细胞因子活性水平。

2 . 免疫学检测法

细胞因子均可借助免疫学方法检测。常用方法包括ELISA(双抗体夹心法或竞争法)、RIA及免疫印迹法等

3 . 单个细胞分泌细胞因子测定

可采用反向溶血空斑试验、酶联免疫斑点试验。

4 . 细胞内细胞因子检测

5 . 分子生物学方法

应用细胞因子cDNA探针或根据已知核苷酸序列人工合成的寡核苷酸探针,经放射性核素(32P或35P)、生物素或地高辛标记,与提取的细胞因子mRNA或DNA分别进行DNA-RNA杂交(Northern blot)或DNA-DNA杂交(Southern blot);亦可在细胞或组织切片上进行原位杂交分析;若同时结合免疫组化技术,还可鉴定表达细胞因子基因的细胞类型。

6 . 细胞因子受体检测

►活细胞吸收试验

►放射性核素标记重组细胞因子的放射性受体分析

►抗细胞因子受体单克隆抗体测定法

►重组细胞因子与受体交联分析

►可溶性细胞因子受体检测

(四)黏附分子的检测

1.细胞膜表面黏附分子检测

间接免疫荧光法、流式细胞术、双抗体夹心ELISA或非竞争性放射免疫分析法。

2.可溶性黏附分子测定

目前在多采用双抗体夹心ELISA法

三、免疫相关基因检测

免疫相关基因检测涉及测定编码各类细胞表面受体和免疫分子基因、表达、遗传多态性及基因重排等,主要工具是核酸探针(如cDNA探针、寡核苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等)cDNA探针或人工合成的寡核苷酸探针常用于Northern blot及斑点杂交;RNA探针因穿透性好,更适用于原位杂交。

核酸探针技术的应用已程序化,以cDNA探针为例,主要包括:①质粒DNA提取;②靶DNA片段分离;③靶DNA片段标记;④待测样品mRNA提取;⑤标记cDNA探针与待测样品进行杂交;⑥放射自显影或显色分析。

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