1、配液：将50ml浓缩洗涤液（20×）用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用，此洗涤液同时作为稀释液使用。

2、参比品的稀释: 每支冻干参比品溶于1.667 ml稀释液，即为0.3 μg/ml。将参比品稀释为0.300μg/ml、0.100μg/ml、0.0333μg/ml、0.0111μg/ml、0.0037μg/ml、0.0012μg/ml、0.0004μg/ml、0.0001μg/ml浓度的系列，备用（详见附件1）。 （即1∶3倍倍比稀释：0.4ml稀释液＋0.2ml上个稀释倍数参比品）

3、样品稀释：先将样品作1∶50稀释（精确取20μl血清加入980μl洗涤液中混匀）备用。

4、加样：第1行（空白对照A1）和阴性、阳性对照孔（各1~2孔）、参比品各浓度的孔不加稀释液。每份待检标本做1∶50、1∶150、1∶450、1∶1350四个稀释度。

5、参比品加样：将8个稀释度的参比品各取100μl加到酶标板相应的孔内。空白对照孔不加样品。

6、阳性对照、阴性对照各加1-2孔，每孔100μl。

7、置25℃孵育120分钟。

8、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤4遍，甩干。

9、直接加入液体酶：每孔（包括空白对照孔）加入液体酶标试剂100ml，置25℃孵育2小时。

10、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，甩干。

11、显色：将铝铂袋中2片底物（p-硝基苯基磷酸盐）用药勺取出后溶解于10.0ml底物缓冲液中，完全溶解后，每孔加入100ml，25℃显色2小时后每孔加终止液50ml，放置5分钟后测定。

12、测定：设定酶标仪波长为405nm（建议用双波长检测参比波长≥600nm）用空白孔调零点后测定各孔OD值。

1、空白孔吸光值＜0.1，阳性对照吸光值 > 0.50 ，阴性对照吸光值 ＜ 0.25试验成立。

2、以参比品抗体浓度作为横坐标、吸光值作为纵坐标,作四参数对数分析法（y = b+(a-b)/(1+xc)^d ）计算，回归方程的拟合度R2≥0.95。

3、待检样品各稀释度的吸光值(y)在标准曲线对应范围内的值代入方程，计算出不同稀释度时血清样品的抗体含量（ X mg/ml）。

4、将抗体含量乘以对应的样品稀释度求出血清抗体含量的均值。

5、最好选择样品吸光值在0.3~1.5之间的代入方程式，此时计算结果较为真实。样品吸光值超出方程范围的吸光值不得代入方程计算抗体含量。

1、试剂盒从冷藏环境中取出后，在室温平衡15-30分钟方可使用。

2、未用完的预包酶标微孔条用封板膜封存在冷藏环境，7-10天内用完。

3、抗人酶结合物加入稀释后可以置37℃保温5分钟便于完全溶解；溶解后未用完酶结合物置-20℃保存。

4、酶标板洗涤时各孔均需加满洗液，防止非特异性抗体、游离酶残留。

5、加样时应先加样品，后加标准品，再加阴性对照、阳性对照。整个加样过程应在15分钟内完成。

6、终止液为3M氢氧化钠，使用时应注意安全。

7、操作应按说明书严格进行，不同批次试剂不得混用。

8、人群流行病学调查可做4个稀释度或2个稀释度（1∶50、1∶150、1∶450、1∶1350）。

9、样品吸光值超出拟合方程范围的吸光值不得代入方程计算抗体含量。样品的抗体浓度通过多个稀释度的平均值计算得到，且不同稀释浓度得出的抗体浓度的变异系数（CV）大于30％，需要检查数据中是否有不合适的结果（如重复性不好，和/或非线性），如果没有发现明显的原因，则要重新测定。

10、每次测定均应同时作标准曲线。

11、每个试剂盒测定的标准曲线只能用于本试剂盒酶标板测定的血清，不能用于其他试剂盒测定结果的计算。

1、储存条件：2-8℃。

2、有效期：12个月。