1、配液：将50ml浓缩洗涤液（20×）用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用，此洗涤液同时作为稀释液使用。

2、参比品的稀释: 每支冻干参比品溶于5 ml稀释液，即为1.0 μg/ml。将参比品稀释为0.12μg/ml、0.10μg/ml、0.08μg/ml、0.06μg/ml、0.04μg/ml、0.02μg/ml、0.01μg/ml、0.005μg/ml浓度的系列，备用（详见附件1） 。

3、样品稀释：先将样品作1∶100稀释（精确取10μl血清加入990μl洗涤液中混匀）备用。

4、加样：第1行（空白对照A1）和阴性、阳性对照孔（各1~2孔）、参比品各浓度的孔不加稀释液。每份待检标本做1∶100、1∶200、1∶400、1∶800四个稀释度。

5、参比品加样：将8个稀释度的参比品各取100μl加到酶标板相应的孔内。空白对照孔不加样品。

6、阳性对照、阴性对照各加1-2孔，每孔100μl。

7、置37℃孵育60分钟。

8、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤4遍，甩干。

9、加酶：每支冻干抗人IgG酶结合物溶于0.2ml洗涤液，完全溶解后用洗涤液作1∶120倍稀释。每孔（包括空白对照孔）加入已稀释酶标试剂100μl，置37℃孵育30分钟。

10、洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，甩干。

11、显色：显色剂A、B液等体积混匀后每孔加入100μl，37℃避光显色10分钟，之后每孔加终止液50μl。

12、测定：设定酶标仪波长为450nm（建议用双波长检测参比波长≥600nm），用空白孔调零点后测定各孔吸光值。

1、阳性对照A450nm > 0.50 ，阴性对照A450nm ＜ 0.20试验成立。

2、以标准品抗体浓度作为横坐标、吸光值作为纵坐标作直线回归方程，方程式为y= a + bx。

3、将待检样品的吸光值(y)代入方程中计算出不同稀释度时血清样品的抗体含量（ Xμg/ml）。

4、将抗体含量乘以对应的样品稀释度求出血清抗体含量的均值。

5、样品吸光值超出直线回归方程范围的吸光值不得代入方程计算抗体含量。

6、计算样品抗体含量时，最好选择样品吸光值在0.3~1.0之间的代入方程式，此时计算结果较为真实。

1、试剂盒从冷藏环境中取出后，在室温平衡15-30分钟方可使用。

2、未用完的预包酶标微孔条用封板膜封存在冷藏环境，7-10天内用完。

3、抗人酶结合物加入稀释后可以置37℃保温5分钟便于完全溶解；溶解后未用完酶结合物置-20℃保存。

4、酶标板洗涤时各孔均需加满洗液，防止非特异性抗体、游离酶残留。

5、加样时应先加样品，后加标准品，再加阴性对照、阳性对照。整个加样过程应在15分钟内完成。

6、终止液为2M硫酸，使用时应注意安全。

7、操作应按说明书严格进行，不同批次试剂不得混用。

8、人群流行病学调查可做4个稀释度或2个稀释度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800）。

9、样品吸光值超出直线回归方程范围的吸光值不得代入方程计算抗体含量，吸光值低于检测线性范围的，应降低血清稀释倍数重新测定，血清可做1:25 及1:50稀释用于测定。

10、每次测定均应同时作标准曲线。

11、每个试剂盒测定的标准曲线只能用于本试剂盒酶标板测定的血清，不能用于其他试剂盒测定结果的计算。

1、储存条件：2-8℃。

2、有效期：12个月。